高效液相色譜儀儲液器中的流動相被高壓泵打入系統，樣品溶液經進樣器進入流動相，被流動相載入色譜柱(固定相) 內，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數，在兩相中做相對運動時，經過反復多次的吸附- 解吸的分配過程，各組分在移動速度上產生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱內流出，通過檢測器時，樣品濃度被轉換成電信號傳送到記錄儀，數據以圖譜形式打印出來。
高效液相色譜儀的使用注意事項：
1、流動相必須用HPLC 級的試劑，使用前過濾除去其中的顆粒性雜質和其他物質(使用0.45um或更細的膜過濾)。
2、流動相過濾后要用超聲波脫氣，脫氣后應該恢復到室溫后使用。
3、不能用純乙腈作為流動相，這樣會使單向閥粘住而導致泵不進液。
4、使用緩沖溶液時，做完樣品后應立即用去離子水沖洗管路及柱子一小時，然、后用甲醇(或甲醇水溶液)沖洗40分鐘以上，以充分洗去離子。對于柱塞桿外部，做完樣品后也必須用去離子水沖洗 20ml以上。
5、長時間不用儀器，應該將柱子取下用堵頭封好保存，注意不能用純水保存柱子，而應該用有機相(如甲醇等)，因為純水易長霉。
